การแยกเซลล์ PriCells-Mice Spleen Dendritic Cells-Collagenase Digestion เพื่อเตรียมสารแขวนลอยเซลล์ม้าม
โปรแกรมเสริม:
การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์ม้ามโดยการย่อยคอลลาเจนเนส
วัสดุทดลอง:
1. คอลลาเจนเนส D 4000U/มล. ละลายและวางบนน้ำแข็ง
2. HBSS ฆ่าเชื้อ มี Ca + , Mg 2+ (ซื้อใน Life Technologies)
3. ม้ามของเมาส์
4. เข็มฉีดใต้ผิวหนัง เส้นผ่านศูนย์กลาง 22G × 1 1/2 (เบคตัน ดิกคินสัน)
5. เข็มฉีดยาแบบใช้แล้วทิ้งขนาด 10 มล. หรือ 5 มล. (เช่น Becton Dickinson)
6. จานเพาะเชื้อเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 มม. (เช่น ฟอลคอน)
7. กายวิภาคของฟันเลื่อยของหม้อนึ่งความดัน 2 อัน (เช่น Roboz)
8. ตาข่ายสแตนเลสแบบนึ่งฆ่าเชื้อ: ตัดตาข่ายสแตนเลส 40 ตาข่ายเป็นสี่เหลี่ยมเล็ก ๆ ขนาด 5 ซม. × 5 ซม. พับขอบลงแล้วงอทั้งสี่ด้านลงในชามสี่เหลี่ยมตื้น ฟอยล์ถูกห่อและนึ่งฆ่าเชื้อ
วิธีการทดลอง:
1. เจือจางคอลลาจีเนส D 4,000 U/ml จำนวน 2 หลอด (เพียงพอสำหรับม้าม 20 ตัว): HBSS 1 มล. จำนวน 9 มล. (เจือจางเป็น 4000 U/ml ขั้นตอนที่ 8), HBSS 39 มล. 1 มล. (เจือจางเป็น 100 U/) มล.) วางบนน้ำแข็ง
2. ติดเข็ม 22G เข้ากับกระบอกฉีดยาขนาด 10 มล. ที่บรรจุคอลลาเจนเนส 100 U/ml เติมสารละลาย 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร 10 มล. ลงในจานเพาะเชื้อขนาด 100 มม.
3. นำจานเพาะเชื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 มม. อีกอันมาใช้งาน ถือคีมในมือข้างหนึ่ง กระบอกฉีดยาในมืออีกข้าง และนิ้วหัวแม่มืออยู่บนลูกสูบ ม้ามของหนูถูกหนีบด้วยคีม และขอบแคบของแคปซูลม้ามถูกแทงด้วยเข็ม และฉีดคอลลาเจนเนส 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร 100 มิลลิลิตร ใช้คีมดันม้ามไปทางเข็มแล้วขยับเข็มไปสักสองสามมิลลิเมตร ฉีดคอลลาเจนเนสซ้ำๆ และต่อเนื่องจนกระทั่งฉีดคอลลาเจนเนส 1 มิลลิลิตรเข้าไปในม้าม และเข็มเจาะม้ามจากปลายอีกด้านหนึ่ง
4. ใช้เข็มฉีกม้ามแล้วย้ายไปใส่จานเพาะเลี้ยงที่มีคอลลาเจนเนส (ขั้นตอนที่ 2) ทำซ้ำจนกระทั่งม้ามทั้งหมดถูกฉีดและฉีกขาด
5. เก็บเซลล์แขวนลอยจากจานที่สอง แล้วเติมลงในหลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 50 มล. วางบนน้ำแข็ง ล้างจานด้วยคอลลาจีเนส 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร 3 มล. และเติมลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 50 มล. ข้างต้น
6. เติมคอลลาเจนเนส 100 U/ml 3 มล. ลงในจานเพาะเชื้อ ม้ามที่ฉีกฝอยถูกย้ายไปยังจานเพาะเชื้อตามลำดับ พวกเขาถูกฉีกด้วยแหนบ 2 อันเป็นชิ้นเล็กๆ ด้านข้างขนาด 1 มม. เพื่อให้สามารถทะลุเส้นผ่านศูนย์กลางด้านในของปิเปตขนาด 5 มล. ได้ หลังจากฉีกม้ามทั้งหมดแล้ว ให้เติมสารละลายคอลลาเจนเนสในจานเพาะเชื้อที่วางไว้ก่อนหน้านี้บนชิ้นม้ามและเป่าอย่างรุนแรงหลายครั้งด้วยปิเปตขนาด 5 มล.
7. เอียงจานเพาะเลี้ยง เอาเศษชิ้นส่วนขนาดใหญ่ออก และย้ายสารแขวนลอยเซลล์ไปยังหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 50 มล. ที่วางบนน้ำแข็งในขั้นตอนที่ 5 ล้างจานด้วยคอลลาจีเนส 100 U/ml สองสามมิลลิลิตร แล้วเติมลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยง
8. เติมคอลลาเจนเนส 400 U/ml 10 มล. ลงในชิ้นม้ามที่เหลืออยู่ในจาน หลังจากปิเปตหลายครั้งแล้ว ให้นำไปแช่ในตู้ฟักเป็นเวลา 30-90 นาที
9. ในขั้นตอนสุดท้ายของการฟัก ให้ทุบชิ้นส่วนแล้วดูดลงบนตาข่ายเหล็กปลอดเชื้อที่มีจานเพาะเชื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 มม.
10. ยึดปลายด้านหนึ่งของลายฉลุด้วยแหนบ ล้างชิ้นส่วนด้วยคอลลาจีเนส 100 U/ml สองสามมิลลิลิตร จากนั้นบดชิ้นส่วนด้วยลูกสูบเข็มฉีดยาขนาด 5 มล. ทุบจนกระทั่งวัสดุสีแดงทั้งหมดหลุดออกจากเนื้อเยื่อ ตาข่ายเหล็กถูกล้างด้วยคอลลาจีเนส 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สองสามมิลลิลิตร
11. นำลายฉลุออกจากจานเพาะเลี้ยง และทิ้งเม็ดยึดติดที่ไม่มีสีออก ของเหลวในจานเพาะเลี้ยงถูกเป่าอย่างรุนแรงและถ่ายโอนไปยังหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 50 มล. ของขั้นตอนที่ 7 ล้างจานด้วยคอลลาจีเนส 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สองสามมิลลิลิตร และเติมลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยง (เซลล์เดนไดรต์ประมาณ 0.5% หรือน้อยกว่า)
12. หากจำเป็น ให้ปั่นเหวี่ยงด้วย BSA ที่มีความหนาแน่นสูง
ภาคผนวก:
เซลล์เม็ดเลือดแดงแกะที่ผันแอนติบอดี (EA):
เม็ดเลือดแดงแกะที่เก็บรวบรวม 2.5 มล. (สกัดในสารละลาย Alsever; Cocalico) ถูกล้างด้วย PBS 3 ครั้งและปั่นแยกที่ 350 กรัมเป็น เวลา 5 นาทีหลังการซักแต่ละครั้ง ต่อจากนั้นมันถูกเจือจางจนถึงสารแขวนลอยเซลล์ 5% (10 9 เซลล์/มิลลิลิตร) ด้วย PBS สด ซีรั่มต้านเม็ดเลือดแดงของกระต่ายที่มีความไวสูงถูกเจือจาง 1:50 ในสารแขวนลอยเซลล์ 5% (อาจก่อให้เกิดปริมาณยาที่ต่ำกว่ากลุ่มกลูติเนตของแอนติบอดี) ฟักตัวเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง และค่อยๆ กลับด้านสารละลายเป็นครั้งคราว EA ที่ก่อตัวขึ้นถูกล้าง 3 ครั้งด้วย RPMI 1640 (Life Technologies) และจากนั้น EA ถูกเจือจางจนถึงสารแขวนลอยของเซลล์ 5% ด้วย PBS เก็บที่อุณหภูมิ 4 ° C เป็นเวลา 2 สัปดาห์แล้วล้างด้วย RPMI หนึ่งครั้งก่อนใช้งาน
สื่อสมบูรณ์ RPMI-5:
สื่อ RPMI1640 (Life Technologies) ประกอบด้วย:
5% FBS ปิดใช้งานความร้อนที่ 56 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
10 มิลลิโมล/ลิตร เฮปส์
เจนตามิซินซัลเฟต 20 มก. / มล. (เทคโนโลยีชีวิต)
50มิลลิโมล/มล. 2-ME
การกรองฆ่าเชื้อ
โซลูชัน BSA ความหนาแน่นสูง:
ในขวดวัดปริมาตรขนาด 1 ลิตร ให้เติม PBS 186 มล., NaOH 1 โมล/ลิตร 29 มล., น้ำ 65 มล. (ระวัง ระวังของเหลวและอย่ากระเด็นในขวด) อย่าคนให้เข้ากัน ใช้ BSA 106 กรัม (Cohn เศษส่วน V แนะนำ BSA แบบเต็ม) บนพื้นผิวของสารละลาย ปิดด้วยฟอยล์ดีบุก และแช่เย็นข้ามคืนเพื่อละลาย BSA อย่างช้าๆ
วันรุ่งขึ้น การเขย่าเบาๆ กลายเป็นสารละลายสีน้ำตาลใสเล็กน้อย ดัชนีการหักเหของแสงจะวัดเป็นทศนิยมตำแหน่งที่สี่ที่ใกล้ที่สุด ความหนาแน่นที่ถูกต้องของ BSA (1.080 กรัม/มิลลิลิตร) มีดัชนีการหักเหของแสง 1.384 ถึง 1.385 ที่ 25 °C หลังจากแก้ไขดัชนีการหักเหของแสงแล้ว วัดค่า pH ด้วยกระดาษทดสอบ ค่า pH ควรอยู่ระหว่าง 7.0 ถึง 7.4 และโดยทั่วไปไม่จำเป็นต้องทำการปรับเปลี่ยนใดๆ
โซลูชั่นการกรองปราศจากเชื้อ ตัวกรอง 47 มม. (ชนิดมิลพอร์) ถูกวางไว้ด้านบนของหน่วยตัวกรอง 500 มล. (Nalgene #156-4045) และตัวกรองถูกทำให้เปียกด้วย BSA จำนวนเล็กน้อย กรองสูญญากาศสักสองสามนาทีจนกว่า BSA จะถูกกรองออก ถอดปั๊มสุญญากาศออกและค่อยๆ เติมสารละลาย BSA ที่เหลือลงในอ่างเก็บที่ส่วนบนของตัวกรอง (หลีกเลี่ยงไม่ให้เกิดฟอง ใช้ปั๊มสุญญากาศและตัวกรองเพื่อกรอง BSA ที่เหลือ ≥ 10 นาที) สามารถเก็บไว้ได้ 3 เดือนที่อุณหภูมิ 4 °C
Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
