โบวีน คอลลาเจนเนส (Collagenase) ELISA

คู่มือการใช้งานชุด

รีเอเจนต์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยเท่านั้น: ชุดนี้ใช้เพื่อตรวจสอบปริมาณคอลลาเจนเนสในซีรั่มของวัว พลาสมา และตัวอย่างของเหลวที่เกี่ยวข้อง

หลักการทดลอง:

ชุดนี้ใช้วิธีดับเบิลแอนติบอดีแซนวิชเพื่อกำหนดระดับของคอลลาเจนเนสจากวัวในตัวอย่าง เคลือบไมโครเพลทด้วยแอนติบอดี้คอลลาเจนเนสจากวัวบริสุทธิ์ (Collagenase) เพื่อสร้างแอนติบอดีเฟสของแข็ง จากนั้นเติมคอลลาเจนเนส (Collagenase) ลงในไมโครเวลส์ที่เคลือบโมโนโคลนอล แอนติบอดีตามลำดับ จากนั้นรวมกับแอนติบอดีคอลลาเจนเนสที่มีป้ายกำกับ HRP เพื่อสร้างคอมเพล็กซ์แอนติบอดีที่มีฉลากแอนติบอดี-แอนติเจน-เอนไซม์ และหลังจากการล้างอย่างละเอียด TMB ของสารตั้งต้นจะถูกเพิ่มเพื่อการพัฒนาสี TMB จะถูกแปลงเป็นสีน้ำเงินภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ HRP และเปลี่ยนเป็นสีเหลืองสุดท้ายภายใต้การกระทำของกรด ความลึกของสีมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับคอลลาเจนเนสในตัวอย่าง วัดการดูดกลืนแสง (ค่า OD) ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร และความเข้มข้นของคอลลาเจนเนสจากวัว (คอลลาเจนเนส) ในตัวอย่างคำนวณโดยเส้นโค้งมาตรฐาน

องค์ประกอบชุด:

องค์ประกอบของชุดอุปกรณ์

การกำหนดค่า 48 หลุม

การกำหนดค่า 96 หลุม

บันทึก

คำแนะนำ

1 เสิร์ฟ

1 เสิร์ฟ

ฟิล์มซีล

2 ชิ้น (48)

2 ชิ้น (96)

ถุงปิดผนึก

1

1

แผ่นเคลือบเอนไซม์

1 × 48

1 × 96

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

สินค้ามาตรฐาน: 360ng/ml

0.5มล. × 1 ขวด

0.5มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

การเจือจางมาตรฐาน

1.5 มล. × 1 ขวด

1.5 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

รีเอเจนต์ของเอนไซม์

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

สารเจือจางตัวอย่าง

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

นักพัฒนาของเหลว

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

นักพัฒนา B ของเหลว

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

หยุดการแก้ปัญหา

3มล. × 1 ขวด

6มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

น้ำยาซักผ้าสูตรเข้มข้น

(20มล. × 20 เท่า) × 1 ขวด

(20มล. × 30 เท่า) × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

การประมวลผลตัวอย่างและข้อกำหนด:

1. เซรั่ม: เลือดที่อุณหภูมิห้องจะแข็งตัวตามธรรมชาติเป็นเวลา 10-20 นาที ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) เก็บส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวังและปั่นแยกอีกครั้งหากมีตะกอนปรากฏขึ้นระหว่างการเก็บรักษา

2. พลาสมา: ควรเลือก EDTA หรือโซเดียมซิเตรตเป็นสารกันเลือดแข็งตามความต้องการของตัวอย่าง โดยผสมเป็นเวลา 10-20 นาที และปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2,000-3,000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ควรปั่นแยกอีกครั้ง

3. ปัสสาวะ: เก็บในหลอดปลอดเชื้อและปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ให้ปั่นแยกอีกครั้ง เยื่อหุ้มปอดและน้ำในช่องท้อง การใช้อ้างอิงน้ำไขสันหลัง

4. ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์: เมื่อตรวจพบส่วนประกอบที่หลั่งออกมา ให้เก็บด้วยหลอดฆ่าเชื้อ ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง เมื่อตรวจพบส่วนประกอบภายในเซลล์ ให้เจือจางสารแขวนลอยของเซลล์ด้วย PBS (PH7.2-7.4) และความเข้มข้นของเซลล์จะสูงถึงประมาณ 1 ล้าน/มิลลิลิตร ด้วยการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ เซลล์จะถูกทำลายและส่วนประกอบภายในเซลล์จะถูกปล่อยออกมา ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ควรปั่นแยกอีกครั้ง

5. จัดระเบียบชิ้นงานทดสอบ: หลังจากตัดชิ้นงานแล้ว ให้ชั่งน้ำหนัก เพิ่ม PBS, PH7.4 จำนวนหนึ่ง แช่แข็งอย่างรวดเร็วและบันทึกด้วยไนโตรเจนเหลวเพื่อใช้ในภายหลัง หลังจากที่ชิ้นงานหลอมละลาย ยังคงรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 2-8 ° C เพิ่ม PBS จำนวนหนึ่ง (PH7.4) และทำให้ชิ้นงานเป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องแบบแมนนวลหรือแบบโฮโมจีไนเซอร์ ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หลังจากแบ่งส่วนแล้ว ส่วนหนึ่งจะถูกทดสอบ และส่วนที่เหลือจะถูกแช่แข็งเพื่อใช้ในอนาคต

6. ควรเก็บตัวอย่างโดยเร็วที่สุดหลังจากเก็บตัวอย่าง การสกัดควรดำเนินการตามเอกสารที่เกี่ยวข้อง ควรทำการทดลองโดยเร็วที่สุดหลังจากการสกัด หากไม่สามารถดำเนินการทดสอบได้ทันที สามารถเก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิ -20 ℃ แต่ควรหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

7. ไม่สามารถตรวจพบตัวอย่างที่มี NaN3 ได้ เนื่องจาก NaN3 ยับยั้งการทำงานของฮอร์แรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP)

ขั้นตอน:

1. การเจือจางและการโหลดผลิตภัณฑ์มาตรฐาน: ตั้งหลุมมาตรฐาน 10 หลุมบนแผ่นเคลือบเอนไซม์ เพิ่มผลิตภัณฑ์มาตรฐาน 100 ไมโครลิตรในหลุมที่หนึ่งและสอง จากนั้นเพิ่มผลิตภัณฑ์มาตรฐานในหลุมที่หนึ่งและสอง 50μlของเจือจาง ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำ100μlจากหลุมแรกและหลุมที่สองแล้วเพิ่มลงในหลุมที่สามและสี่ตามลำดับ จากนั้นเติมสารเจือจางมาตรฐาน 50μl ไปยังหลุมที่สามและสี่ตามลำดับ ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำ50μl ในแต่ละหลุมในหลุมที่สามและสี่แล้วทิ้งไป จากนั้นเพิ่ม 50μl ในแต่ละหลุมในหลุมที่ห้าและหก จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50ul ลงในหลุมที่ห้าและหกตามลำดับ และผสมให้เข้ากัน หลังจากผสมแล้ว ให้นำ50μlจากหลุมที่ห้าและหกและเพิ่มลงในหลุมที่เจ็ดและแปดตามลำดับ จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50 ไมโครลิตรลงในหลุมที่ 7 และ 8 ตามลำดับ นำ50μlจากบ่อทั้งแปดและเพิ่มลงในบ่อที่เก้าและสิบ จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50μl ลงในหลุมที่เก้าและสิบ หลังจากผสมแล้ว ให้นำ50μlจากหลุมที่เก้าและสิบแล้วทิ้งไป (หลังจากการเจือจาง ปริมาตรของแต่ละหลุมคือ 50μl และความเข้มข้นคือ 240ng / ml, 160ng / ml, 80ng / ml, 40ng / ml, 20ng / ml)

2. เพิ่มตัวอย่าง: ตั้งค่าหลุมว่าง (หลุมควบคุมเปล่าไม่ได้เพิ่มตัวอย่างและรีเอเจนต์ของเอนไซม์ ขั้นตอนที่เหลือจะเหมือนกัน) และหลุมตัวอย่างที่จะทดสอบ เติมตัวเจือจางตัวอย่าง 40μl ลงในหลุมตัวอย่างทดสอบของแผ่นเคลือบเอนไซม์ จากนั้นเติมตัวอย่าง 10μl ที่จะทดสอบ (การเจือจางสุดท้ายของตัวอย่างคือ 5 ครั้ง) เพิ่มตัวอย่างและเพิ่มตัวอย่างลงที่ด้านล่างของหลุมของไมโครเพลท พยายามอย่าสัมผัสผนังของหลุม เขย่าเบาๆ เพื่อผสม

3. การฟักไข่: ปิดแผ่นด้วยแผ่นปิดผนึกแล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที

4. สารละลายผสม: เจือจางน้ำยาล้างจานเข้มข้น 30 เท่า (20 เท่าของ 48T) ด้วยน้ำกลั่น 30 เท่า (20 เท่าของ 48T) แล้วจึงใช้งาน

5. การซัก: ค่อยๆ ลอกฟิล์มปิดผนึกออก ทิ้งของเหลว ปั่นแห้ง เติมน้ำยาล้างในแต่ละหลุม ปล่อยทิ้งไว้ 30 วินาทีแล้วทิ้ง ทำซ้ำ 5 ครั้ง ซับให้แห้ง

6. เพิ่มเอนไซม์: เติมรีเอเจนต์ฉลากเอนไซม์50μlลงในแต่ละหลุม ยกเว้นหลุมว่าง

7. การฟักตัว: การดำเนินการเหมือนกับ 3.

8. การซัก: การทำงานเหมือนกับ 5.

9. การพัฒนาสี: เติมนักพัฒนา A 50μl ลงในแต่ละหลุม จากนั้นเติมนักพัฒนา B 50μl ผสมเบาๆ และพัฒนาที่อุณหภูมิ 37 ° C ในที่มืดเป็นเวลา 15 นาที

10. การสิ้นสุด: เติมสารละลายหยุด 50μl ลงในแต่ละหลุมเพื่อหยุดปฏิกิริยา (ในเวลานี้สีน้ำเงินจะเปลี่ยนเป็นสีเหลือง)

11. การกำหนด: วัดค่าการดูดกลืนแสง (ค่า OD) ของแต่ละหลุมตามลำดับโดยใช้เครื่องปรับอากาศเปล่าที่ศูนย์และความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร ควรทำการวัดภายใน 15 นาทีหลังจากเติมสารละลายหยุด

ข้อควรระวัง:

1. ควรปรับชุดอุปกรณ์ให้สมดุลที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15-30 นาที ก่อนนำออกจากสภาพแวดล้อมที่แช่เย็น หากไม่ได้เปิดแผ่นเคลือบฉลากเอนไซม์ ควรเก็บแถบดังกล่าวไว้ในถุงปิดผนึก

2. ผลึกอาจตกตะกอนในน้ำยาซักผ้าเข้มข้น ซึ่งสามารถให้ความร้อนและละลายในอ่างน้ำในระหว่างการเจือจาง และผลลัพธ์จะไม่ได้รับผลกระทบในระหว่างการซัก

3. ควรใช้เครื่องเก็บตัวอย่างในการเติมตัวอย่างแต่ละขั้นตอน และควรตรวจสอบความแม่นยำอย่างสม่ำเสมอเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการทดสอบ ทางที่ดีควรควบคุมเวลาสุ่มตัวอย่างภายใน 5 นาที หากมีตัวอย่างจำนวนมากแนะนำให้ใช้ปืนวอลเลย์เพิ่มตัวอย่าง

4. โปรดสร้างเส้นโค้งมาตรฐานในเวลาเดียวกันของการวัดแต่ละครั้ง ควรทำเป็นรูคู่ หากปริมาณของสารทดสอบในชิ้นงานสูงเกินไป (ค่า OD ของตัวอย่างมากกว่าค่า OD ของหลุมแรกของหลุมมาตรฐาน) โปรดเจือจางสารเจือจางตัวอย่างเป็นทวีคูณ (n เท่า) ก่อน จากนั้นจึงหาค่าดังกล่าว เมื่อคำนวณโปรดคูณผลคูณการเจือจางรวม (× n × 5)

5. ฟิล์มปิดผนึกจำกัดให้ใช้เพียงครั้งเดียวเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้าม

6. โปรดเก็บพื้นผิวให้ห่างจากแสง

7. ปฏิบัติตามคำแนะนำอย่างเคร่งครัด และผลการทดสอบจะต้องถูกกำหนดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท

8. ตัวอย่าง น้ำยาล้างจาน และของเสียต่างๆ ทั้งหมดควรถือเป็นสารติดเชื้อ

9. ส่วนประกอบของชุดต่างๆ ของรีเอเจนต์นี้จะต้องไม่ผสมกัน

10. หากมีความแตกต่างกับคู่มือภาษาอังกฤษ ให้ใช้คู่มือภาษาอังกฤษเป็นหลัก

การคำนวณ:

โดยให้ความเข้มข้นของมาตรฐานเป็นค่า Abscissa และค่า OD เป็นค่ากำหนด

วาดเส้นโค้งมาตรฐานบนกระดาษพิกัดตาม OD ของกลุ่มตัวอย่าง

ค่าจะถูกกำหนดโดยเส้นโค้งมาตรฐาน แล้วคูณด้วยการเจือจาง

หลายรายการ; หรือคำนวณมาตรฐานโดยใช้ความเข้มข้นและค่า OD ของมาตรฐาน

สมการการถดถอยเชิงเส้นของเส้นโค้งเสมือน ซึ่งเป็นค่า OD ของกลุ่มตัวอย่าง

แทนลงในสมการ คำนวณความเข้มข้นของตัวอย่าง และคูณด้วยการเจือจาง

ผลคูณคือความเข้มข้นที่แท้จริงของตัวอย่าง

(ภาพนี้ใช้สำหรับอ้างอิงเท่านั้น)

ประสิทธิภาพของชุดอุปกรณ์:

1. ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ R ระหว่างการถดถอยเชิงเส้นของกลุ่มตัวอย่างและความเข้มข้นที่คาดหวังสูงกว่า 0.95

2. ชุดและการอนุมัติจะต้องน้อยกว่า 9% และ 11% ตามลำดับ

ช่วงการสอบ:

5ng / มล. –300ng / มล

เงื่อนไขในการจัดเก็บและระยะเวลาที่ใช้ได้:

1. เก็บชุดอุปกรณ์: 2-8 ℃

2. ความถูกต้อง: 6 เดือน