คำแนะนำของ Rat Collagenase II (Collagenase II) Enzyme Linked Immunoassay (ELISA)

บริษัทของเราเป็นผู้จัดจำหน่ายชุดอุปกรณ์ ELISA ราคายุติธรรม บริการหลังการขาย การขาย และหลังการขายอยู่ที่บริการของคุณ ให้บริการทดสอบฟรี กรุณาโทรหาเรา!

หนูคอลลาเจนเนส II (ELISA)

คู่มือการใช้งานชุด

รีเอเจนต์นี้ใช้สำหรับการวิจัยเท่านั้น

วัตถุประสงค์: ชุดนี้ใช้เพื่อระบุปริมาณของ Collagenase II ในซีรั่มของหนู พลาสมา และตัวอย่างของเหลวที่เกี่ยวข้อง

หลักการทดลอง:

ชุดนี้ใช้วิธีดับเบิลแอนติบอดีเพื่อกำหนดระดับของคอลลาเจนเนส II ในตัวอย่าง เพลตที่มีรูพรุนขนาดเล็กถูกเคลือบด้วยแอนติบอดีคอลลาเจนเนส II ของหนูแรทบริสุทธิ์เพื่อสร้างแอนติบอดีเฟสของแข็ง คอลลาเจนเนส II ถูกเติมลงในไมโครเวลส์ที่เคลือบโมโนโคลนอลแอนติบอดีตามลำดับ ตามด้วยแอนติบอดีคอลลาเจนเนส II (Collagenase II) ที่มีฉลาก HRP จับกันเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์แอนติบอดีที่มีฉลากแอนติบอดี-แอนติเจน-เอนไซม์ หลังจากล้างอย่างละเอียดแล้ว จะเติมสารตั้งต้น TMB เพื่อเพิ่มสีสัน TMB จะถูกแปลงเป็นสีน้ำเงินภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ HRP และเปลี่ยนเป็นสีเหลืองสุดท้ายภายใต้การกระทำของกรด ความลึกของสีมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับคอลลาเจนเนส II ในตัวอย่าง วัดค่าการดูดกลืนแสง (ค่า OD) ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร และความเข้มข้นของคอลลาเจนเนส II (Collagenase II) ในหนูในตัวอย่างคำนวณโดยเส้นโค้งมาตรฐาน

การประมวลผลตัวอย่างและข้อกำหนด:

1. เซรั่ม: เลือดที่อุณหภูมิห้องแข็งตัวตามธรรมชาติเป็นเวลา 10-20 นาที ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) เก็บส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวังและปั่นแยกอีกครั้งหากมีตะกอนปรากฏขึ้นระหว่างการเก็บรักษา

2. ปัสสาวะ: เก็บในหลอดปลอดเชื้อและปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ให้ปั่นแยกอีกครั้ง เยื่อหุ้มปอดและน้ำในช่องท้อง การใช้อ้างอิงน้ำไขสันหลัง

3. พลาสมา: ควรเลือก EDTA หรือโซเดียมซิเตรตเป็นสารต้านการแข็งตัวของเลือดตามความต้องการของตัวอย่าง หลังจากผสมเป็นเวลา 10-20 นาที ให้ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ควรปั่นแยกอีกครั้ง

4. ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์: เมื่อตรวจพบส่วนประกอบที่หลั่งออกมา ให้เก็บด้วยหลอดฆ่าเชื้อ ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง เมื่อตรวจพบส่วนประกอบภายในเซลล์ ให้เจือจางสารแขวนลอยของเซลล์ด้วย PBS (PH7.2-7.4) และความเข้มข้นของเซลล์จะสูงถึงประมาณ 1 ล้าน/มิลลิลิตร ด้วยการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ เซลล์จะถูกทำลายและส่วนประกอบภายในเซลล์จะถูกปล่อยออกมา ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หากมีการตกตะกอนเกิดขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ควรปั่นแยกอีกครั้ง

5. จัดระเบียบชิ้นงานทดสอบ: หลังจากตัดชิ้นงานแล้ว ให้ชั่งน้ำหนัก เพิ่ม PBS, PH7.4 จำนวนหนึ่ง แช่แข็งอย่างรวดเร็วและบันทึกด้วยไนโตรเจนเหลวเพื่อใช้ในภายหลัง หลังจากที่ชิ้นงานหลอมละลาย ยังคงรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 2-8 ° C เพิ่ม PBS จำนวนหนึ่ง (PH7.4) และทำให้ชิ้นงานเป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องแบบแมนนวลหรือแบบโฮโมจีไนเซอร์ ปั่นแยกเป็นเวลาประมาณ 20 นาที (2000-3000 รอบต่อนาที) รวบรวมส่วนเหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง หลังจากแบ่งส่วนแล้ว ส่วนหนึ่งจะถูกทดสอบ และส่วนที่เหลือจะถูกแช่แข็งเพื่อใช้ในอนาคต

6. ควรเก็บตัวอย่างโดยเร็วที่สุดหลังจากเก็บตัวอย่าง การสกัดควรดำเนินการตามเอกสารที่เกี่ยวข้อง ควรทำการทดลองโดยเร็วที่สุดหลังจากการสกัด หากไม่สามารถดำเนินการทดสอบได้ทันที สามารถเก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิ -20 ℃ แต่ควรหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

7. ไม่สามารถตรวจพบตัวอย่างที่มี NaN3 ได้ เนื่องจาก NaN3 ยับยั้งการทำงานของฮอร์แรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP)

ข้อควรระวัง:

1. ผลึกอาจตกตะกอนในน้ำยาซักผ้าเข้มข้น ซึ่งสามารถให้ความร้อนและละลายในอ่างน้ำในระหว่างการเจือจาง และผลลัพธ์จะไม่ได้รับผลกระทบในระหว่างการซัก

2. ฟิล์มปิดผนึกจำกัดให้ใช้เพียงครั้งเดียวเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้าม

3. ควรใช้เครื่องเก็บตัวอย่างในการเติมตัวอย่างแต่ละขั้นตอน และควรตรวจสอบความแม่นยำอย่างสม่ำเสมอเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการทดสอบ ทางที่ดีควรควบคุมเวลาสุ่มตัวอย่างภายใน 5 นาที หากมีตัวอย่างจำนวนมากแนะนำให้ใช้ปืนวอลเลย์เติมตัวอย่าง

4. ควรปรับชุดอุปกรณ์ให้สมดุลที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15-30 นาที ก่อนนำออกจากสภาพแวดล้อมที่แช่เย็น หากไม่ได้เปิดแผ่นเคลือบฉลากเอนไซม์ ควรเก็บแถบดังกล่าวไว้ในถุงปิดผนึก

5. โปรดสร้างเส้นโค้งมาตรฐานในเวลาเดียวกันของการวัดแต่ละครั้ง ควรทำเป็นรูคู่ หากปริมาณของสารทดสอบในชิ้นงานสูงเกินไป (ค่า OD ของตัวอย่างมากกว่าค่า OD ของหลุมแรกของหลุมมาตรฐาน) โปรดเจือจางสารเจือจางตัวอย่างเป็นทวีคูณ (n เท่า) ก่อน จากนั้นจึงหาค่าดังกล่าว เมื่อคำนวณโปรดคูณผลรวมการเจือจางทั้งหมด (× n × 5)

6. โปรดเก็บพื้นผิวให้ห่างจากแสง

7. ปฏิบัติตามคำแนะนำอย่างเคร่งครัด และผลการทดสอบจะต้องถูกกำหนดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท

8. ตัวอย่าง น้ำยาล้างจาน และของเสียต่างๆ ทั้งหมดควรถือเป็นสารติดเชื้อ

9. ส่วนประกอบของชุดต่างๆ ของรีเอเจนต์นี้จะต้องไม่ผสมกัน

10. หากมีความแตกต่างกับคู่มือภาษาอังกฤษ ให้ใช้คู่มือภาษาอังกฤษเป็นหลัก

องค์ประกอบชุด:

องค์ประกอบของชุดอุปกรณ์

การกำหนดค่า 48 หลุม

การกำหนดค่า 96 หลุม

บันทึก

คำแนะนำ

1 เสิร์ฟ

1 เสิร์ฟ

ฟิล์มซีล

2 ชิ้น (48)

2 ชิ้น (96)

ถุงปิดผนึก

1

1

แผ่นเคลือบเอนไซม์

1 × 48

1 × 96

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

สินค้ามาตรฐาน: 2700ng / L

0.5มล. × 1 ขวด

0.5มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

การเจือจางมาตรฐาน

1.5 มล. × 1 ขวด

1.5 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

รีเอเจนต์ของเอนไซม์

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

สารเจือจางตัวอย่าง

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

นักพัฒนาของเหลว

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

นักพัฒนา B ของเหลว

3 มล. × 1 ขวด

6 มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

หยุดการแก้ปัญหา

3มล. × 1 ขวด

6มล. × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

น้ำยาซักผ้าสูตรเข้มข้น

(20มล. × 20 เท่า) × 1 ขวด

(20มล. × 30 เท่า) × 1 ขวด

เก็บที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

ขั้นตอน

1. เพิ่มตัวอย่าง: ตั้งค่าหลุมเปล่าแยกกัน (หลุมควบคุมเปล่าไม่ได้เพิ่มตัวอย่างและรีเอเจนต์ที่ติดฉลากเอนไซม์ ขั้นตอนที่เหลือจะเหมือนกัน) และหลุมตัวอย่างที่จะทดสอบ เติมตัวเจือจางตัวอย่าง 40μl ลงในหลุมตัวอย่างทดสอบของแผ่นเคลือบเอนไซม์ จากนั้นเติมตัวอย่าง 10μl ที่จะทดสอบ (การเจือจางสุดท้ายของตัวอย่างคือ 5 ครั้ง) เพิ่มตัวอย่างและเพิ่มตัวอย่างลงที่ด้านล่างของหลุมของไมโครเพลท พยายามอย่าสัมผัสผนังของหลุม เขย่าเบาๆ เพื่อผสม

2. การเจือจางและการโหลดผลิตภัณฑ์มาตรฐาน: ตั้งหลุมมาตรฐาน 10 หลุมบนแผ่นเคลือบเอนไซม์ เพิ่มผลิตภัณฑ์มาตรฐาน 100 ไมโครลิตรในหลุมที่หนึ่งและสอง จากนั้นเพิ่มผลิตภัณฑ์มาตรฐานในหลุมที่หนึ่งและสอง 50μlของตัวเจือจาง ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำ100μlจากหลุมแรกและหลุมที่สองแล้วเพิ่มลงในหลุมที่สามและสี่ตามลำดับ จากนั้นเติมสารเจือจางมาตรฐาน 50μl ไปยังหลุมที่สามและสี่ตามลำดับ ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำ50μl ในแต่ละหลุมในหลุมที่สามและสี่แล้วทิ้งไป จากนั้นเพิ่ม 50μl ในแต่ละหลุมในหลุมที่ห้าและหก จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50ul ลงในหลุมที่ห้าและหกตามลำดับ และผสมให้เข้ากัน หลังจากผสมแล้ว ให้นำ50μlจากหลุมที่ห้าและหกและเพิ่มลงในหลุมที่เจ็ดและแปดตามลำดับ จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50 ไมโครลิตรลงในหลุมที่ 7 และ 8 ตามลำดับ นำ50μlจากบ่อทั้งแปดและเพิ่มลงในบ่อที่เก้าและสิบ จากนั้นเติมสารละลายเจือจางมาตรฐาน 50μl ลงในหลุมที่เก้าและสิบ หลังจากผสมแล้ว ให้นำ50μlจากหลุมที่เก้าและสิบแล้วทิ้งไป (หลังจากการเจือจาง ปริมาตรของแต่ละหลุมคือ 50μl และความเข้มข้นคือ 1800ng / L, 1200ng / L, 600ng / L, 300ng / L, 150ng / L)

3. การฟักไข่: ปิดแผ่นด้วยแผ่นปิดผนึกแล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที

4. สารละลายผสม: เจือจางน้ำยาล้างจานเข้มข้น 30 เท่า (20 เท่าของ 48T) ด้วยน้ำกลั่น 30 เท่า (20 เท่าของ 48T) แล้วจึงใช้งาน

5. การซัก: ค่อยๆ ลอกฟิล์มซีลออก ทิ้งของเหลว ปั่นแห้ง เติมน้ำยาล้างจานในแต่ละหลุม ปล่อยทิ้งไว้ 30 วินาที แล้วทิ้ง ทำซ้ำ 5 ครั้ง แล้วลูบไล้ให้แห้ง

6. การฟักตัว: การดำเนินการเหมือนกับ 3.

7. การซัก: การทำงานเหมือนกับ 5.

8. การพัฒนาสี: เพิ่มนักพัฒนา A 50μl ลงในแต่ละหลุม จากนั้นเพิ่มนักพัฒนา B 50μl ผสมเบาๆ และพัฒนาที่อุณหภูมิ 37 ° C ในที่มืดเป็นเวลา 15 นาที

9. เพิ่มเอนไซม์: เติมรีเอเจนต์ฉลากเอนไซม์50μlลงในแต่ละหลุม ยกเว้นหลุมว่าง

10. การสิ้นสุด: เติมสารละลายหยุด 50μl ลงในแต่ละหลุมเพื่อหยุดปฏิกิริยา (ในเวลานี้สีน้ำเงินจะเปลี่ยนเป็นสีเหลือง)

11. การกำหนด: วัดค่าการดูดกลืนแสง (ค่า OD) ของแต่ละหลุมตามลำดับโดยใช้เครื่องปรับอากาศเปล่าที่ศูนย์และความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร ควรทำการวัดภายใน 15 นาทีหลังจากเติมสารละลายหยุด

เงื่อนไขในการจัดเก็บและระยะเวลาที่ใช้ได้:

1. เก็บชุดอุปกรณ์: 2-8 ℃

2. ความถูกต้อง: 6 เดือน

ประสิทธิภาพของชุดอุปกรณ์:

1. ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ R ระหว่างการถดถอยเชิงเส้นของกลุ่มตัวอย่างและความเข้มข้นที่คาดหวังสูงกว่า 0.95

2. ชุดและการอนุมัติจะต้องน้อยกว่า 9% และ 11% ตามลำดับ

ช่วงการสอบ:

100ng / ลิตร -2000ng / ลิตร

การคำนวณ:

ใช้ความเข้มข้นของมาตรฐานเป็นค่า abscissa และค่า OD เป็นค่ากำหนด วาดเส้นโค้งมาตรฐานบนกระดาษพิกัด และค้นหาความเข้มข้นที่สอดคล้องกันจากเส้นโค้งมาตรฐานตามค่า OD ของตัวอย่าง จากนั้นคูณด้วยปัจจัยการเจือจาง คำนวณสมการการถดถอยเชิงเส้นของเส้นโค้งมาตรฐานด้วยค่า OD แทนที่ค่า OD ของตัวอย่างลงในสมการ คำนวณความเข้มข้นของตัวอย่าง และคูณด้วยปัจจัยการเจือจางเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่แท้จริงของตัวอย่าง