วิธีการย่อยคอลลาเจนเนส - การเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์สายสะดือ

เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัลจากสายสะดือของมนุษย์มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงสูง มียีนที่เสถียร ไม่ไวต่อการกลายพันธุ์ และไม่ก่อให้เกิดเนื้องอก ไม่จำเป็นต้องจับคู่และไม่มีการปฏิเสธ และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการรักษาโรคและการวิจัยการต่อต้านวัย ปัจจุบันการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมความงามและกลุ่มย่อยสุขภาพก็ได้รับความสนใจมากขึ้นเรื่อยๆ

สายสะดือของเซลล์ต้นกำเนิดจากสายสะดือประกอบด้วยแคปซูล หมากฝรั่งฮั่วทง หลอดเลือดดำสะดือ และสะดือของหลอดเลือดแดงสะดือ เซลล์ต้นกำเนิดจากสายสะดือมีอยู่ในเหงือกของ Huatong
เนื่องจากมีปริมาณน้อย จำนวนเซลล์ที่ได้รับหลังจากการย่อยด้วยคอลลาเจนเนสจึงมีน้อย นอกจากนี้เมื่อได้รับคอลลาเจนโดยวิธีการย่อยคอลลาเจนเนสทั่วไป คอลลาเจนเนสจะเป็นอันตรายต่อเซลล์มากขึ้นและเซลล์เพาะเลี้ยงจะอยู่ในสภาพที่ไม่ดี

วิธีการแพทช์เป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการเพาะเลี้ยงเซลล์มีเซนไคมัลสายสะดือของมนุษย์ แต่เซลล์จะหลุดออกจากเนื้อเยื่อเป็นเวลานาน (10-20 วันหรือนานกว่านั้น) หลังจากการสำรวจอย่างต่อเนื่อง เราพบวิธีที่จะได้เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์จากสายสะดือโดยการย่อยคอลลาเจนเนส

วิธีดำเนินการเฉพาะมีดังนี้:
1 หลังจากตัดสายสะดือของทารกและสายสะดือของมารดาแล้ว ให้หนีบด้วยที่หนีบสายสะดือทันทีเพื่อป้องกันการปนเปื้อนภายใน บรรจุลงในถุงปลอดเชื้อ (ภาชนะ) แล้วส่งไปยังห้องปฏิบัติการ
2 ในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพหรือม้านั่งที่สะอาด ให้ถอดสายสะดือออกแล้วแช่แอลกอฮอล์ 75% เป็นเวลา 2 นาที (หลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 50 มล. หรือจานขนาด 250px) หากสายสะดือยาวและไม่สามารถบรรจุลงในภาชนะได้ สามารถตัดสายสะดือได้ประมาณ 250px แต่ต้องเพิ่มแคลมป์สายสะดือก่อนตัด เพื่อป้องกันไม่ให้แอลกอฮอล์เข้าสู่สายสะดือและทำลายเซลล์
3 หลังการบำบัดด้วยแอลกอฮอล์ ให้รีบย้ายไปยังภาชนะที่เต็มไปด้วย PBS หรือน้ำเกลือ 2 ครั้ง ครั้งละ 2 นาที
4 ตัดคลิปสายสะดือออก ตัดสายสะดือออกเป็น 2-75px ส่วน ใช้กรรไกรตัดสายสะดือจากด้านในของหลอดเลือดดำสะดือ และใช้แมงป่องแมงป่อง (เนื้อเยื่อสายสะดือค่อนข้างลื่น โดยมีแมงป่องทำงาน) ไปที่หลอดเลือดดำสะดือ หลอดเลือดแดงสะดือ และสายสะดือ ซองจดหมายจะถูกลบออกเพื่อป้องกันการรวมตัวของเซลล์เบ็ดเตล็ด
5 ตัดเนื้อเยื่อสายสะดือด้วยกรรไกร เจือจางคอลลาเจนเนสชนิด II 0.1% (สารละลายเจือจางด้วย DMEM/F12) ข้ามคืน และย่อยข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 °C
6 ในวันถัดไป เททิชชู่ที่ยังไม่ได้ย่อยลงบนตะแกรงเหล็ก 100 mesh (80 mesh, 160 mesh) (ควรเป็นตะแกรงเหล็กที่มีเนื้อเยื่อจำนวนมากเพื่อการใช้งานที่ง่ายดาย) โดยใช้ PBS (หรือน้ำเกลือ) ล้างหลายๆ ครั้งเพื่อกำจัดคอลลาเจนเนสออกจากพื้นผิวของเนื้อเยื่อให้ได้มากที่สุด สุดท้ายให้ล้างด้วยสื่อที่สมบูรณ์ 1-2 ครั้งเพื่อขจัด PBS (หรือน้ำเกลือ)
7 เทลงในจาน (ไม่สะดวกที่จะใส่ในขวด) เพิ่มการเพาะเลี้ยงขนาดกลางจำนวนเล็กน้อยบนบล็อกเนื้อเยื่อที่ไม่ได้ย่อย (6ml บวก 2-3ml, 10ml บวก 3-4ml) (จุดประสงค์คือเพื่อลดคอลลาเจนที่ตกค้างบนเซลล์) เจ็บ) วันรุ่งขึ้น บล็อกเนื้อเยื่อก็หายไปอย่างสมบูรณ์ (คอลลาจีเนสที่แช่อยู่ในเนื้อเยื่อถูกย่อย) เซลล์ก็กระจัดกระจายไปหมด และภายใต้กล้องจุลทรรศน์ มีเซลล์จำนวนมากที่กระจัดกระจายอยู่ในเนื้อเยื่อที่ถูกย่อยแล้ว เติมสื่อจำนวนเล็กน้อย (150 px บวก 2-3 มล., 250 px บวก 4-5 มล.) ลงในสื่อและวัฒนธรรมยังคงดำเนินต่อไป
8 หลังจากผ่านไปสองวัน ให้เติมสื่อในปริมาณเล็กน้อยต่อไป (150px บวก 2-3ml, 250px บวก 4-5ml)
9 หลังจากหนึ่งหรือสองวัน จำนวนเซลล์จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (การเจริญเติบโตของโคโลนีจำนวนมาก) ถ่ายโอนไปยังหลอดปั่นแยกขนาด 50 มล. สองหลอด เติม PBS (หรือน้ำเกลือ) ลงใน 50 มล. ผสม ปั่นแยกที่ 2500 รอบต่อนาที 6 นาที
10 แขวนตะกอนอีกครั้งใน 5-6 มล. (ขึ้นอยู่กับจำนวนเซลล์) ในตัวกลางที่สมบูรณ์ ปั่นแยกที่ 1000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 6 นาที ใส่ในขวด T25 และเติมตัวกลางที่สมบูรณ์ 5 มล.
หลังจากผ่านไป 13 วัน สามารถเพาะต่อได้โดยการเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อหรือเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ 3-4 มิลลิลิตร ทุกสามวันให้เปลี่ยนของเหลวจนหมด (สามารถส่งต่อได้มากกว่า 70%)

บันทึกวิวรณ์:
1 วิธีนี้ใช้งานง่ายและใช้เวลาฟักตัวสั้น
2 การย่อยสายสะดือด้วยคอลลาเจนเนสที่อุณหภูมิ 37 ° C โดยพื้นฐานแล้วสายสะดือสามารถย่อยได้ภายในไม่กี่ชั่วโมง แต่ในขณะเดียวกันความเสียหายต่อเซลล์ก็มีมากกว่า คอลลาเจนเนสสามารถเจาะเข้าไปในเนื้อเยื่อสายสะดือได้ และคอลลาเจนเนสที่มีความเข้มข้นต่ำจะย่อยเนื้อเยื่อจากภายในสู่ภายนอก ทำให้เซลล์เสียหายน้อยลง (ทริปซินมีผลการย่อยอาหารที่ไม่ดีต่อเนื้อเยื่อสายสะดือ)
3 สาเหตุที่ย่อยเนื้อเยื่อได้หมดและไม่แยกเซลล์ออกจากกัน เนื่องจากส่วนประกอบของคอลลาเจนในสะดือ (หนืด) ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์จากสายสะดือ เซลล์ส่วนใหญ่ถูกแขวนลอยอยู่ในคอลลาเจนและขยายตัวในโคโลนี ซึ่งเป็นสาเหตุหลักว่าทำไมเซลล์จึงอยู่ในสภาพที่ดี
4 เมื่อทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดจากสายสะดือ ห้ามใช้สื่อที่มีเซรั่ม (เซรั่มส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของเซลล์) แต่ควรใช้สื่อเฉพาะสำหรับเซลล์ต้นกำเนิด ทางเดินอาหารยังพยายามไม่ทำให้การย่อยด้วยทริปซิน (ทริปซินสร้างความเสียหายต่อเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัลสายสะดือ) ควรใช้น้ำย่อยชนิดพิเศษเพื่อให้แน่ใจว่ามีเวลาผ่านไปมากขึ้น