คู่มือการใช้งานสำหรับ Rat Collagenase I ELISA Kit

คู่มือการใช้งานสำหรับ Rat Collagenase I ELISA Kit

ชุดนี้มีไว้สำหรับการวิจัยนอกร่างกายเท่านั้น ไม่ใช่สำหรับการวินิจฉัยทางคลินิก!

แอปพลิเคชั่นที่ตั้งใจไว้

ใช้วิธีการ ELISA เพื่อตรวจสอบปริมาณของ Collagenase I ในซีรั่มของหนู พลาสมา หรือของเหลวทางชีวภาพอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง

หลักการทดลอง

เคลือบแผ่นไมโครเวลล์ด้วยแอนติบอดีคอลลาเจนเนส I บริสุทธิ์เพื่อสร้างพาหะแบบโซลิดเฟส เพิ่มตัวอย่างหรือสารมาตรฐาน แอนติบอดี biotinylated Collagenase I และ Avidin ที่มีฉลาก HRP ลงในไมโครเวลส์ตามลำดับ หลังจากการล้างอย่างละเอียด การพัฒนาสีด้วยซับสเตรต (TMB) TMB จะถูกแปลงเป็นสีน้ำเงินภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของเปอร์ออกซิเดส และเปลี่ยนเป็นสีเหลืองสุดท้ายภายใต้การกระทำของกรด ความลึกของสีมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับคอลลาเจนเนส I ในตัวอย่าง วัดค่าการดูดกลืนแสง (ค่า) ที่ 450 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทเพื่อคำนวณความเข้มข้นของตัวอย่าง

องค์ประกอบของชุดอุปกรณ์และการเตรียมรีเอเจนต์

1. ไมโครเพลท: ชิ้นเดียว (96 หลุม)

2. ผลิตภัณฑ์มาตรฐาน (ผลิตภัณฑ์ไลโอฟิไลซ์): 2 ขวด โปรดเตรียมภายใน 15 นาที ก่อนใช้งาน แต่ละขวดจะถูกเจือจางเป็น 1 มล. พร้อมกับเจือจางตัวอย่าง หลังจากปิดฝาแล้ว ปล่อยให้ยืนที่อุณหภูมิห้องประมาณ 10 นาที ขณะเดียวกันก็กลับด้าน/ถูซ้ำๆ เพื่อช่วยละลาย ความเข้มข้นของมันคือ 100 ng / ml ทำการเจือจางหลายๆ ครั้งในจาน) และเตรียม 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml, 1.56 ng/ml และเจือจางตัวอย่างโดยตรง 0 ng/ml เป็นหลุมว่าง ตัวอย่างเช่น ในการเตรียมมาตรฐาน 50ng / ml: ใช้ 0.5 มล. (ไม่น้อยกว่า 0.5 มล.) ของมาตรฐานข้างต้น 100ng / ml แล้วเติมลงในหลอด Eppendorf ที่มีตัวเจือจางตัวอย่าง 0.5 มล. ผสมให้เข้ากัน และความเข้มข้นที่เหลือสามารถอนุมานได้โดยการเปรียบเทียบ

3. ตัวเจือจางตัวอย่าง: 1 × 20 มล.

4. ทดสอบการเจือจาง A: 1 × 10 มล.

5. ทดสอบเจือจาง B: 1 × 10ml.

6. โซลูชันการตรวจจับ A: 1 × 120 ต่อขวด (1: 100) ก่อนใช้งาน ให้เจือจางด้วย Test Diluent A 1: 100 (เช่น: 10 Test Solution A / 990 Test Diluent A) ผสมให้เข้ากัน และเตรียมตามจำนวนรวมที่คำนวณไว้ล่วงหน้าที่จำเป็นสำหรับการทดลองแต่ละครั้ง (100 / หลุม) ควรเตรียม 0.1-0.2ml เพิ่มเติมระหว่างการเตรียมจริง

7. โซลูชันการตรวจจับ B: 1 × 120 ต่อขวด (1: 100) เจือจาง 1: 100 ด้วยการทดสอบเจือจาง B ทันทีก่อนใช้งาน วิธีการเจือจางจะเหมือนกับวิธีทดสอบสารละลาย A

8. สารละลายพื้นผิว: 1 × 10 มล. / ขวด

9. น้ำยาล้างจานสูตรเข้มข้น: 1 × 30 มล./ขวด โดยแต่ละขวดเจือจางด้วยน้ำกลั่น 25 ครั้ง

10. สารละลายหยุด: 1 × 10 มล. / ขวด (2 โมล / ลิตร H2SO4)

11. การเคลือบ : 5 แผ่น

12. คู่มือการใช้งาน : 1 ชุด

นำสิ่งของมาเอง

1. เครื่องอ่านไมโครเพลท (แนะนำให้อุ่นเครื่องก่อนใช้งาน)

2. อุปกรณ์จ่ายสารขนาดเล็กและทิปปิเปต, ท่อ EP

3. น้ำกลั่นหรือปราศจากไอออน กระดาษกรอง

การรวบรวมและการเก็บรักษาตัวอย่าง

1. เซรั่ม: ควรเก็บตัวอย่างเลือดครบไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมงหรือ 4 ชั่วโมงข้ามคืน หลังจากการปั่นแยกที่ 1,000 กรัม เป็นเวลา 20 นาที ให้นำส่วนลอยเหนือตะกอนไปตรวจจับ หรือเก็บส่วนลอยเหนือตะกอนไว้ที่ -20 หรือ -80 แต่หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ .

2. พลาสมา: EDTA หรือเฮปารินสามารถใช้เป็นยาต้านการแข็งตัวของเลือดได้ ปั่นแยกตัวอย่างที่ 1000 กรัม เป็นเวลา 15 นาที ภายใน 30 นาทีหลังการเก็บตัวอย่าง ส่วนเหนือตะกอนสามารถนำมาตรวจจับได้ หรือส่วนเหนือตะกอนควรเก็บไว้ที่ -20 หรือ -80 แต่ต้องแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

3. ตัวอย่างทางชีวภาพอื่นๆ: ปั่นเหวี่ยงที่ 1,000 กรัม เป็นเวลา 20 นาที นำส่วนลอยเหนือตะกอนไปทดสอบ หรือเก็บส่วนลอยเหนือตะกอนไว้ที่ -20 หรือ -80 แต่หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

หมายเหตุ: ควรปิดผนึกและจัดเก็บตัวอย่างข้างต้น 4 ชิ้นควรเก็บไว้น้อยกว่า 1 สัปดาห์ -20 ไม่ควรเกิน 1 เดือน -80 ไม่ควรเกิน 2 เดือน ภาวะเม็ดเลือดแดงแตกของตัวอย่างจะส่งผลต่อผลการทดสอบขั้นสุดท้าย ดังนั้นจึงไม่ควรทดสอบตัวอย่างภาวะเม็ดเลือดแดงแตก

ขั้นตอน

ก่อนเริ่มการทดลอง รีเอเจนต์ทั้งหมดควรปรับให้สมดุลกับอุณหภูมิห้อง และไม่ควรละลายรีเอเจนต์โดยตรงที่ 37 เมื่อเตรียมรีเอเจนต์หรือตัวอย่าง จะต้องผสมให้เข้ากัน และพยายามหลีกเลี่ยงไม่ให้เกิดฟองเมื่อผสม ควรคาดการณ์เนื้อหาตัวอย่างก่อนการทดสอบ หากความเข้มข้นของตัวอย่างสูงเกินไป ควรเจือจางตัวอย่างเพื่อให้ตัวอย่างเจือจางตรงกับช่วงการตรวจจับของชุดอุปกรณ์ จากนั้นคูณด้วยปัจจัยการเจือจางที่สอดคล้องกันเมื่อคำนวณ

1. เพิ่มตัวอย่าง: ตั้งค่ารูเปล่า รูมาตรฐาน และรูตัวอย่างที่จะทดสอบตามลำดับ เติมตัวเจือจางตัวอย่าง 100% ลงในหลุมว่าง และ 100% ของสารมาตรฐานหรือตัวอย่างที่จะทดสอบในหลุมที่เหลือ ระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ เพิ่มตัวอย่างที่ด้านล่างของแผ่นเอนไซม์เมื่อเติมตัวอย่าง พยายามอย่าสัมผัสผนังบ่อน้ำ ปิดหรือปิดแผ่นเป้าหมายแล้วฟักที่ 37 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เพื่อให้มั่นใจว่าผลการทดลองมีความถูกต้อง

สำหรับการทดสอบแต่ละครั้ง โปรดใช้โซลูชันมาตรฐานใหม่

2. ทิ้งของเหลวและทำให้แห้งโดยไม่ต้องซัก เติมสารละลายสำหรับตรวจจับ A จำนวน 100 สารละลาย (เตรียมไว้ก่อนใช้งาน) ลงในแต่ละหลุม เพิ่มไมโครเพลทลงในเมมเบรน และบ่มที่ 37 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

3.ทิ้งของเหลวในรู ปั่นแห้ง ล้างจาน 3 ครั้ง แช่ครั้งละ 1-2 นาที ประมาณหลุมละ 400 ปั่นแห้ง (สามารถซับของเหลวในรูให้แห้งได้เช่นกัน)

4. เติมน้ำยาทดสอบ B 100% (เตรียมไว้ก่อนใช้งาน) ลงในแต่ละหลุม เติมสารเคลือบ และบ่มที่ 37 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

5. เทของเหลวลงในรู ปั่นแห้ง ล้างจาน 5 ครั้ง วิธีเดียวกับขั้นตอนที่ 3

6. เติมสารละลายซับสเตรต 90 ต่อหลุม แผ่นฉลากเอนไซม์ และฟิล์ม 37 เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดสี (เวลาปฏิกิริยาจะถูกควบคุมที่ 15-30 นาที เมื่อ 3-4 หลุมแรกของหลุมมาตรฐานมีการไล่ระดับสีฟ้าที่ชัดเจน 3 หลุมสุดท้าย - เมื่อการไล่ระดับสีของ 4 หลุมไม่ชัดเจน ก็สามารถยุติได้)

7. เติมสารละลายหยุด 50% ในแต่ละหลุมเพื่อหยุดปฏิกิริยา ในเวลานี้สีน้ำเงินเปลี่ยนเป็นสีเหลือง ลำดับการเพิ่มสารละลายหยุดควรเหมือนกับลำดับของสารละลายซับสเตรต

8. วัดความหนาแน่น (ค่า) แสงของแต่ละหลุมทันทีด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

บันทึก:

1. การเตรียมรีเอเจนต์: รีเอเจนต์ทั้งหมดควรปรับให้สมดุลกับอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน โปรดเก็บรีเอเจนต์ตามคำแนะนำทันทีหลังการใช้งาน โปรดใช้ทิปแบบใช้แล้วทิ้งในระหว่างการทดลองเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้าม

2. การเพิ่มตัวอย่าง: เมื่อเพิ่มตัวอย่างหรือเติมรีเอเจนต์ หากช่วงเวลาระหว่างหลุมแรกและหลุมสุดท้ายใหญ่เกินไป จะส่งผลให้เวลา "ก่อนฟักตัว" แตกต่างกัน ซึ่งจะส่งผลต่อความแม่นยำและความสามารถในการทำซ้ำของค่าที่วัดได้อย่างชัดเจน เวลาของการเติมตัวอย่างหนึ่งครั้ง (รวมถึงตัวอย่างมาตรฐานและตัวอย่างทั้งหมด) จะถูกควบคุมได้ดีที่สุดภายใน 10 นาที ขอแนะนำให้ตั้งค่าหลายหลุมสำหรับการทดลอง

3. การฟักตัว: เพื่อป้องกันไม่ให้ตัวอย่างระเหย ให้วางแผ่นที่มีฉลากเอนไซม์พร้อมฝาปิดหรือเมมเบรนไว้ในกล่องเปียกระหว่างการทดลองเพื่อหลีกเลี่ยงการระเหยของของเหลว ขั้นตอนต่อไปควรดำเนินการโดยเร็วที่สุดหลังจากล้างจาน และควรหลีกเลี่ยงเมื่อใดก็ได้ ไมโครเพลทอยู่ในสภาพแห้ง ในเวลาเดียวกันควรปฏิบัติตามเวลาและอุณหภูมิในการฟักไข่ที่กำหนดอย่างเคร่งครัด

4. การซัก: น้ำยาล้างที่เหลืออยู่ในการทำปฏิกิริยาได้ดีในระหว่างกระบวนการซักควรซับให้แห้งบนกระดาษกรอง อย่าใส่กระดาษกรองลงในบ่อทำปฏิกิริยาโดยตรงเพื่อดูดซับน้ำ ในเวลาเดียวกัน ควรกำจัดของเหลวและรอยนิ้วมือที่เหลืออยู่ที่ด้านล่างของแผ่นเพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบต่อการอ่านค่าเครื่องมือของฉลากเอนไซม์ขั้นสุดท้าย

5. การเตรียมรีเอเจนต์: ก่อนใช้งานโปรดจับมือสองสามครั้งหรือปั่นแยกสักพักเพื่อป้องกันไม่ให้ของเหลวที่อยู่บนผนังท่อหรือฝาขวดสะสมที่ด้านล่างของหลอด ผลิตภัณฑ์มาตรฐาน สารละลายในการทำงาน A และสารละลายในการทำงาน B ควรเตรียมตามปริมาณที่ต้องการ และเตรียมด้วยสารเจือจางที่เกี่ยวข้อง เพื่อไม่ให้สับสน โปรดเตรียมสารละลายมาตรฐานและสารละลายทำงานอย่างถูกต้อง และพยายามอย่าเตรียมในปริมาณเล็กน้อย (เช่น เมื่อวาดสารละลายทดสอบ A ไม่ควรน้อยกว่า 10 ครั้งละ) เพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดด้านความเข้มข้นเนื่องจากการเจือจางที่ไม่ถูกต้อง ห้ามนำสารมาตรฐานที่เจือจางแล้วกลับมาใช้ใหม่ และทดสอบของเหลวทำงานของสารละลาย A, สารละลายตรวจจับ B สารทำงาน

6. การควบคุมเวลาปฏิกิริยา: โปรดสังเกตการเปลี่ยนแปลงสีของปฏิกิริยาอย่างสม่ำเสมอหลังจากเติมสารตั้งต้น (เช่น ทุก 10 นาที) หากสีเข้ม โปรดเพิ่มสารละลายหยุดไว้ล่วงหน้าเพื่อหยุดปฏิกิริยา เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้ปฏิกิริยารุนแรงเกินไปและส่งผลกระทบต่อเครื่องอ่านไมโครเพลท การอ่านความหนาแน่นของแสง

7. วัสดุพิมพ์: โปรดเก็บวัสดุพิมพ์ให้ห่างจากแสง และหลีกเลี่ยงการสัมผัสกับแสงจ้าโดยตรงระหว่างการเก็บรักษาและการบ่มเพาะ

วิธีซัก

1. วิธีการล้างจานแบบแมนนวล: ฉีดบัฟเฟอร์การซักที่แนะนำอย่างน้อย 0.4 มล. ลงในบ่อ แช่ประมาณ 1-2 นาที ดูดออก (อย่าสัมผัสผนังแผ่น) หรือเขย่าของเหลวในแผ่นเอนไซม์ และวางสองสามชั้นบนโต๊ะทดลอง กระดาษดูดซับ โดยวางแผ่นไมโครไทเตอร์ลงและตบเบา ๆ หลายครั้ง ทำซ้ำขั้นตอนนี้หลายครั้งตามต้องการ

2. การล้างจานอัตโนมัติ : หากมีเครื่องล้างจานอัตโนมัติควรใช้ในกระบวนการทดลองอย่างเป็นทางการหลังจากใช้งานอย่างเชี่ยวชาญแล้ว

ความจำเพาะ

ชุดตรวจนี้สามารถตรวจจับคอลลาเจนเนสของหนูชนิดรีคอมบิแนนท์หรือธรรมชาติได้ในเวลาเดียวกัน และไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง

การคำนวณ

ค่ามาตรฐานและค่าตัวอย่างแต่ละค่าจะถูกหักออกจากค่ารูว่าง (แผนภาพ 7 จุด) หากตั้งค่าไว้หลายรู ควรใช้ค่าเฉลี่ยในการคำนวณ ใช้ความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์มาตรฐานเป็นพิกัด (พิกัดลอการิทึม) และค่าเป็นแอบซิสซา (พิกัดลอการิทึม) ให้วาดเส้นโค้งมาตรฐานบนกระดาษพิกัดลอการิทึม ขอแนะนำให้ใช้ซอฟต์แวร์สร้างเส้นโค้งระดับมืออาชีพสำหรับการวิเคราะห์ เช่น ผู้เชี่ยวชาญเส้นโค้ง 1.3 ตามค่าตัวอย่าง ค้นหาความเข้มข้นที่สอดคล้องกันจากเส้นโค้งมาตรฐาน และคูณด้วยปัจจัยการเจือจาง หรือใช้ความเข้มข้นและค่าของมาตรฐานในการคำนวณสมการถดถอยของเส้นโค้งมาตรฐาน แล้วนำตัวอย่าง ค่าของ มาแทนลงในสมการ ความเข้มข้นของตัวอย่างจะถูกคำนวณ แล้วคูณด้วยปัจจัยการเจือจางซึ่งเป็นความเข้มข้นที่แท้จริงของตัวอย่าง

ช่วงการตรวจจับ: 1.56 ng / ml-100 ng / ml โปรดวาดค่าความเข้มข้นต่อไปนี้สำหรับการวาดเส้นโค้งมาตรฐาน: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, 12.5 ng / ml, 6.25 ng / ml, 3.12 ng / ml, 1.56 ng / ml

ขีดจำกัดการตรวจจับขั้นต่ำ: 0.78 ng / mL

คำอธิบาย

1. เนื่องจากสภาพที่มีอยู่และระดับของวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี จึงไม่สามารถดำเนินการระบุและวิเคราะห์วัตถุดิบทั้งหมดที่ซัพพลายเออร์ทุกรายจัดหาให้ได้อย่างครอบคลุม

ผลิตภัณฑ์นี้อาจมีความเสี่ยงด้านคุณภาพและทางเทคนิค

2. ผลการทดลองขั้นสุดท้ายมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับประสิทธิภาพของรีเอเจนต์ การดำเนินการที่เกี่ยวข้องของผู้ทดลอง และสภาพแวดล้อมการทดลองในขณะนั้น โปรดตรวจสอบ

เตรียมตัวอย่างสำรองให้เพียงพอ

3. หลีกเลี่ยงการให้รีเอเจนต์โดนแสงจ้าระหว่างการเก็บและการฟักไข่ ฝาขวดรีเอเจนต์ทั้งหมดจะต้องปิดให้สนิทเพื่อป้องกันการระเหยและการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ เนื่องจากการรบกวนของเอนไซม์โปรตีโอไลติกจะนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

4. การจัดเก็บชุดอุปกรณ์: โปรดเก็บมาตรฐาน โซลูชันการตรวจจับ A และโซลูชันการตรวจจับ B ไว้ที่ -20 โดยเร็วที่สุดหลังจากได้รับชุดอุปกรณ์ และเก็บรีเอเจนต์ที่เหลือไว้ที่ 4 สำหรับการจัดเก็บระยะสั้น และ -20 สำหรับการจัดเก็บระยะยาว หลังจากเปิดแล้ว ควรปิดผนึกไมโครเพลทด้วยสารดูดความชื้นและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 เพื่อหลีกเลี่ยงความชื้น

5. เกลือจะตกตะกอนจากน้ำยาล้างจานเข้มข้น ซึ่งสามารถให้ความร้อนและละลายในอ่างน้ำเมื่อเจือจาง

6. อาจมีสารคล้ายน้ำเล็กน้อยอยู่ในบ่อของแผ่นเชื่อมเอนไซม์ที่เพิ่งเปิด ซึ่งถือเป็นปรากฏการณ์ปกติและจะไม่มีผลกระทบใดๆ ต่อผลการทดลอง

7. ความถูกต้อง: 6 เดือน